Penetapan kadar Pirazinamid menggunakan HPLC

Nama             : Ekhwan Tris Wanto

NIM                : K100110176

Matakuliah    : Analisis Farmasi

Pengampu      : Broto Santoso, S. Farm., Apt.

Penetapan kadar Pirazinamid menggunakan HPLC

Pirazinamid merupakan suatu obat yang memiliki rumus kimia C₅H₅N₃O dengan berat molekul 123,1 g/mol. Pirazinamid mamiliki nama lain pirazin-2-karboksamid. Pirazinamid larut dalam air dan kloroform, sedikit larut dalam etanol 95% dan sangat sukar larut dalam eter. Poirazinamid mempunyai efek sebagai antituberkolosis. Rumus struktur dari pirazinamid adalah sebagai berikut:

Penetapan dengan menggunakan HPLC merupakan salah satu pilihan dari berbagai metode yang dapat digunakan, karena dengan menggunakan HPLC ada beberapa keunggulan, diantaranya adalah simpel, cepat, sederhana, spesifik, dan akurat, serta selektif. Untuk alat yang digunakan adalah instrumen HPLC merk Shumadzi dengan spesifikasi yang dilengkapi menggunakan auto sampel, detektor UV dengan dua softwere yang digunakan. Kolom yang digunakan adalah C8 dengan ukuran 4,6 x 250 mm, 3,5 µm. Fase gerak yang dugunakan untuk analisis pirazinamid adalah baffer pH 4,4 dan metanol dengan rasio 80:20 v/v. Untuk optimasinya adalah sebagai berikut:

Untuk preparasi pada fase gerak adalah sebagi berikut, 100 ml metanol dicampur dengan 400 ml buffer sodium dihidrogen ortofosfat dalam air suling pada pH yang disesuaikan 4,4 menggunakan asam ortodosfor. Kemudian di ultrasonik selama 20 menit dan disaring menggunakan 0,45 µm Nilon 66 (N₆₆) dengan kertas membran 47 mm.

Larutan stok dibuat dengan menimbang seksama 10 mg standar, kemudian dipindahkan kedalam labu alas bulat 100 ml. Stamdar dilarutkan dengan 50 ml fase gerak dan dikocok. Tandai bahwa larutan stok memiliki konsentrasi 0,1% b/v. Setelah itularutan stok disaring menggunakan 0,2 µm Nylon 66 dengan kertas membran 47 mm.

Preparasi sampel dilakukan dengan menimbang 20 tablet pirazinamid kemudian dihitung rata-rata tabletnya. Tablet dihaluskan dengan menggunakan mortir hingga menjadi serbuk, kemudian di timbang 100 mg dan dipindahkan kedalam labu alas bulat. Larutkan dengan fase garaknya kemudian di ultrasonik selama 20 menit dan disaring menggunakan 0,2 µm Nilon 66 (N₆₆) dengan kertas membran 47 mm.

Kondisi kromatografi yang digunakan adalah sebagai berikut: fase gerak metanol dan sodium dihidrogen dengan rasio 20:80 pada pH4,4, kondisi seperti inilah kondisi yang paling optimal yang digunakan untuk penetapan pirazinamid. Flow rate diatur 1,o ml/menit dan panjang gelombang 269 nm dengan suhu kolom 25⁰C. Fase gerak dan sampel di sinifikasi selama 20 menit dan disaring menggunakan 0,45 µm Nilon 66 (N₆₆) dengan kertas membran 47 mm.

Selanjutnya adalah pembuatan kurva baku, yaitu dilakukan dengan cara sebagai berikut. Dibuat beberapa seri konsentrasi yang diambil dari larutanb stok yang sebelumnya telah dibuat dengan konsentrasi 0,1% b/v, yaitu dengan rentang konsntrasi antara 20-120 µg/ml. Pembuatan seri konsentrasi dihitung dengan menggunakan rumus C1xV1=C2xV2. Untuk membuat seri konsentrasi dibuat dengan volume 10 ml per seri konsentrasi, artinya dari rumus tersebut hanya V2 yang belom diketahui, oleh karena itu dicari dengan menggunakan rumus  C1xV1=C2xV2. Misal, untuk membuat seri konsentrasi 20 µg/ml adalah: 0,001 µg/ml x 10 ml = V2 x 20 µg/ml, maka V2 adalah 2 ml. 2 ml tersebut yang kemudian dilarutkan dengan pelarutnya hingga 10 ml. Setelah didapatkan seri konsentrasi kemudian dari masing-masing seri konsentrasi diukur kadarnya dengan HPLC dengan cara menginjekkan ke dalam instrumen HPLC sebanyak 20 µl dengan menggunakan speed injeksi, ditungu hingga hasil keluar dari layar monitor instrumen HPLC. Ketika semua seri sudah terbaca dan didapatkan luas dari peak areanya, hitung regresi linearnya dengan perbandingan konsentrasi vs luas area. Ditulis dengan persamaan y=bx+a.

Setelah dilakukan preparasi sampel dan penetapan kurva baku, kemudian sampel siap ditetapkan kadarnya dengan menggunakan HPLC dengan cara yang sama seperti yang dilakukan pada penetapan kurva baku, yaitu dengan menginjekkan sampel ke dalam instrumen HPLC sebanyak 20 µl dengan menggunakan speed injeksi dan ditungu hingga hasil muncul pada layar monitor instrumen HPLC. Kemudian dihitung kadarnya dengan persamaan yang didapatkan dari kurva baku.